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:::: 보유미생물 > 방선균


 


  본 연구과제에서는 효율적인 생리활성물질탐색을 위해 다음의 두가지 전략을 바탕으로 연구지원하고 있습니다.

첫째, 미생물의 분리에 있어서는 미지의 새로운 미생물 특히 새로운 방선균 또는 곰팡이를 분리. 이용하는 것이고, 둘째, 분리된 미생물 균주를 배양할 때에 배양 조건을 변화시켜 줌으로써 새로운 2차 대사계가 활성화되고 그 결과 지금까지 미 발견되었던 신규 생리활성물질이 탐색될 가능성을 높이는 것입니다.

따라서 첫째, 새로운 균주의 분리와 함께 중복성을 배제한 미생물 균주의 분리를 수행하고, 둘째로는 다수 종 균주가 동시에 다양한 활성물질을 생산할 수 있는 배지조건 등을 검토하여 배양한 후 그 배양액을 지원하는 것입니다.

현재, 지원대상 미생물의 종류로서는 생리활성물질의 67.8%와 22.0%를 각각 생산하여 주목을 받는 방선균과 곰팡이류를 주요 지원대상 미생물 군으로 하고 있습니다. 기타 지원대상 미생물군으로서는 담자균류, myxobateria, 그리고 thermophile, halophile, alkalophile, oligotroph 등 특수환경미생물이 있습니다.

 








  방선균은 자연계에 널리 분포하고 있으며, 토양(산,강,논,밭,동굴등), 식물체, 하천, 호수퇴적층, 해양관련 천연물등 여러시료에서 다양하게 분리되고 있다. 특히 토양이 분포밀도와 다양성이 풍부하다. 그리고 방선균의 존재빈도 및 다양성은 수분, pH, 온도, 심도, 산소농도, 동식물 유래의 유기물함량 등에 의해서 좌우된다.  




  시료의 전처리

방선균은 일반적으로 희석평판법으로서 분리되지만, 시료에 따라서는 방선균에 비해서 다른 미생물, 예를 들면 세균이 훨씬 많다든지 혹은 그대로 도말하였을 때는 출현하는 방선균의 집락수가 아주 적은 경우, 또한 특정 방선균 그룹만을 분리하려고 하는 경우도 있다. 그와같은 경우는 시료를 전처리하여 농축 또는 선택적으로 분리함으로서 보다 효율성을 높일 수 있다. 시료의 전처리 방법은 주로 다음과 같은 관점에서 행해지고 있다.

1) 일반적으로 풍건방법은 일반세균의 생육을 억제함으로서, 방선균의 분리를 용이하게 한다.
2) 방선균중에는 특정한 저.고분자 화합물을 분해, 이용하는 균주가 있는데, 분리시에 이점을 이용한다.
3) 특수한 환경조건하에서 일정기간동안 방치함으로서, 그것에 적응하여 생존하는 것만을 분리한다.
4) 방선균의 포자와 세균등의 영양세포 혹은 방선균포자의 속.종간에 있어서의 물리. 화학적인 성질의 차이를 이용한다.

시료의 각 희석액 0.1ml씩을 HV agar배지에 도말, 28oC에서 7-14일간 배양한 후 순수분리, Bennett`s agar 배지상에 다시 이식하여 28oC에서 7일간 배양한 후 상이한 방선균주를 선별한다.
 







  다양한 방선균의 분리를 위한 배지로는 HV agar배지,Bennett`s(B) agar배지, AGS배지 등이 사용되고, 현재는 주로 HV agar배지를 기본배지로 하여 방선균을 분리하고 있습니다.  

Humic-acid vitamin(HV) agar medium
Humic acid * 1.0g
Na2HPO4 0.5g
KCl 1.71g
MgSO4.7H2O 0.05g
FeSO4.7H2O 0.01g
CaCO3 0.02g
Agar 15-20g
D.W 1L
Vitamin **
Cycloheximide 50ppm
Nalidixic acid 10ppm
pH 7.2
 
Bennett`s(B) agar medium
Glucose 10g
Yeast extract 1g
Bacto-peptone 2g
Beef extract 1g
Agar 15-20g
D.W 1L
Vitamin **
Cycloheximide 50ppm
Nalidixic acid 10ppm
pH 7.2
 
 
* Dissolved in 10ml of 0.2N NaOH
** 0.5mg each of thimine-HCl, riboflavin, niacin, pyridoxin-HCl, inositol, Ca-pantothenate, &-aminobenzoic acid, and 0.25mg of biotin

AGS medium
Arginine mono hydrochloride 1g
Glycerol 12.5g
(specific gravity not less than 1.249 at25oC)
K2HPO4 1g
NaCl 1g
MgSO4.7H2O 0.5g
Fe2(SO4)3.6H2O 0.01g
CuSO4.5H2O 0.001g
ZnSO4.7H2O 0.001g
MnSO4.H2O 0.001g
Agar 15-20g
D.W 1L







Bennett`s(B) agar medium
Glucose 10.0g
Yeast extract 1.0g
Bacto-peptone 2.0g
Beef extract 1.0g
Agar 15.20g
D.W 1L







  방선균의 항생물질 생산을 위한 배지로서는 G.S.S(G) medium, Fish meal (F) medium, P medium, K medium 등이 있고, 현재는 G.S.S(G) medium을 기본으로 방선균을 배양하고 있습니다.  

G.S.S(G) medium
Soluble starch 10g
Glucose 20g
Soybean meal 25g
Beef extract 1g
Yeast extract 4g
NaCl 2g
K2HPO4 0.25g
CaCO3 2g
D.W 1L
pH 7.2
 
 
 
Fish meal (F) medium
Soluble starch 10g
Glucose 20g
Soybean meal 12.5g
Fish meal 12.5g
Beef extract 1g
Yeast extract 4g
NaCl 2g
K2HPO4 0.25g
CaCO3 2g
D.W 1L
pH 7.2
 

G.S.M medium
Soluble starch 10g
Glucose 20g
Molasses 5ml
Yeast extract 5g
Peptone 5g
CaCo3 2g
PH 7.2
   

P medium
Beef extract 10g
polypeton 10g
Glucose 15g
Glycerol 10g
CaCO3 4g
D.W 1L
 
K medium
Slouble starch 25g
Soybean meal 15g
Yeast extract 2g
CaCO3 4g
D.W 1L
pH 6.2-7.0


분리된 균주는 G.S.S배지를 500ml baffled 삼각flask에 50ml씩 넣고 28oC, 150rpm의 조건하에서 6일간 배양한 후 균주와 배양액을 각각 보존하고 있다.
   






년 도 균 주
-   SLI-476 (476 주)
-   HSLI-840 (840 주)
-   1001-1333 (333 주)
1992   20001 - 21540 (1540 주)
1993   30001 - 31319 (1319 주)
1994   40001 - 42236 (2236 주)
1995   50001 - 52078 (2078 주)
1996   60001 - 61042 (1042 주)
1997   70001 - 71951 (1951 주)
1998   80001 - 82787 (2787 주)
1999   90001 - 92777 (2096 주)
2000   000001 - 001554 (639 주)
2001   010001 - 011195 (1047 주)
2002   020001 - 021225 (470 주)
2003   030001 - 030676 (504 주)
2004   AA028~AZ0097 (337 주)
2005   AA050001~ARARE050160 (745 주)
2006   A060001~AH061017 (532 주)
2007   AN070001~AA070294 (1752 주)
2008   AN080001~AN081881 (1832 주)
2009   AN090001~AN092335 (2241 주)
2010   AN100001~AN101043 (1001 주)
2011   AN110001~AN110407 (407 주)
누 계28205 주
 
년 도 배양액
1995   G50972 - 52078 (1107 시료)
1995   M50972 - 52078 (1107 시료)
1996   G60001 - 61042 (1042 시료)
1996   M60001 - 61042 (1042 시료)
1997   G70001 - 71951 (1951 시료)
1997   M70001 - 70538 (538 시료)
1998   G80001 - 82737 (2737 시료)
1999   G90001 - 92777 (2096 시료)
2000   G000001 - 001554 (536 시료)
2000   M000209 - 001554 (460 시료)
2001   G010001 - 011195 (1047 시료)
2001   M010001 - 011195 (1047 시료)
2002   G020001 - G021225 (416 시료)
2002   M020001 - M021225 (411 시료)
2004   AA028~AZ0097 (357 시료)
2005   AA050001~ARARE050160 (629 시료)
2006   A060001~AH061017 (423 시료)
2007   AN070001~AA070294 (1752 시료)
2008   AN080001~AN081881 (1832 시료)
2009   AN090001~AN092335 (2241 시료)
2010   AN100001~AN101043 (1001 시료)
2001   AN110001~AN110407 (407 시료)
누 계24179 시료







...

 






   1. 항균활성 시험균주

  Test microorganisms Abbreviations
Gram negative
bacteria
Escherichia coli BE KCTC 1924 Salmonella typhimurium KCTC 1926 BE
SL
Gram positve bacteria staphylococcus aureus KCTC1916 Staphylococcus aureus KCTC 1928 Bacillus Subtilis KCTC 1914 209
R-209
B
Yeast Candida albicans KCTC 1940
Chlorella regularis
Aspergillus flavus
C


  2. 방선균의 배양액을 paper disc(직경 8mm)에 60㎕씩 흡수시켜 각 시험균주가 도말된 plate에 올려놓고 24시간 후 생성된 투명환의 직경을 측정하여 항균활성을 조사하고 그 data를 종합하고 각 연구자들에게 정보를 제공하고 있습니다.

3. 항균활성 data 등 각종 생리활성 스크리닝결과는 '검색지원 〉생물활성'에서 검색이 가능합니다.